식품 유래 GABA 생성

출처 Freepic

 

 

간장 유래 GABA 생성

능이버섯이 보유한 균주 분리 본 실험에서 사용한 된장과 간장은 전북 부안군에서 전통방식으로 제조한 된장 간장을 채취하여 GABA 생산능을 보유하고 있는 유산균 분리에 사용하였고 유산균의 분리는 MSG가 1% 첨가된 100mL MRS 배지에 전통 된장을 1% 첨가한 뒤 30℃에서 48 시간 배양하였고 배양액을 clean bench에서 1mL을 채취하여 Thin Layer Chromatography(TLC)를 이용하여 GABA 생성 유무를 확인 후 GABA spot이 보이는 실험수를 1% 펩톤 수로 희석하였고 희석액을 고체 배지(MRS Difco USA)에 100μL 분주하여 배양하였고 고체 배지에는 BCP(bromocresol purple Sigma USA) 0.002%를 첨가하였고 콜로니를 얻기 위해 30℃ 48시간 배양하였고 콜로니 중 진한 노란색을 나타내며 주변에 투명한 환을 생성하지 않는 것을 Enterococcus속 Latobacillus속 후보군으로 분리하는 동안 GABA 생성능 검증을 위해 1% MSG가 첨가된 MRS 배지에 후보 유산균을 배양(30℃ 48h)하고 TLC를 활용하여 유산균의 GABA 생성능 여부를 조사하였고 TLC 분석에는 silica gel F 254 (Merck Germany) GABA(Sigma aldrich Korea)를 사용하였으며 이동상 (Butanol Acetic acid Water = 411)으로 시행하였다.

 

 

GABA 생성능의 보유

균주의 동정 GABA 생성능이 있는 된장과 간장 유산균의 동정은 16S rDNA sequence 염기서열 분석으로 하여 동정하였고 균주 동정을 위해 후보 균주로부터 genomic DNA 추출은 DNeasy Blood ＆ Tissue kit (QIAGEN Germany)를 사용하였으며 제조 사의 지침을 따라 gDNA를 추출하였고 PCR에 사용한 primer는 27F(F orw ard)였으며 PCR 은 추출한 gDNA 완충액과 Taq 중합효소를 0.025 U/μL 비율로 제조하여 PCR은 변성(95℃ 30초)과 annealing(55℃ 30초) 그리고 신장(72℃ 1분 30초)으로 35cycle을 통해 증폭을 시켰으며 Biometra thermocycler 기기를 사용하면서 PCR 검증은 전기영동(1% 아가로스 겔)을 통해 확인하였으며 PCR Purification Kit를 이용하여 정제 과정을 거쳐 16S rDNA sequencing 분석을 통해 염기서열 정보를 확보하였고 DNA의 상동성 조사는 확보된 염기서열정보를 NCBI프로그램 (www.ncbi.nlm.nih.gov)을 이용하여 확인하였다.

 

 

간장으로부터 분리한 GABA 생성 균주의 생화학적 특성 분석

확보된 균주의 당 발효패턴 특성에 대해 분석하기 위해 API 50 CHL kit (bioMerieux France)를 이용하였으며 분석방법은 제조사의 지침에 따라 분석하였고 미강과 맥강 그리고 누룩에서 유래한 Ornithine 생성능이 우수한 균주를 분리하여 균주 분리 본 실험에서 사용한 미강은 ㈜남양 농산에서 맥강은 농업회사법인 청맥(주)에서 누룩은 (유) 대신 환경개발에서 제공받아 Ornithine 생산 능을 보유하고 있는 유산균 분리에 사용하였고 유산균의 분리는 Arginine이 1% 첨가된 100mL MRS에 미강 또는 맥강 또는 누룩을 1% 첨가한 뒤 30℃에서 48시간 배양하였고 배양액을 clean bench에서 1mL을 채취하여 TLC를 이용하여 Ornithine 생성 유무를 확인 후 Ornithine spot이 보이는 실험구를 1% 펩톤 수로 희석하였고 희석액을 고체 배지(MRS Difco USA)에 100μL 분주하여 배양하였고 고체 배지에는 BCP(bromocresol purple Sigma USA) 0.002%를 첨가하였으며 콜로니를 얻기 위해 30℃ 48시간 배양하였고 콜로니 중 진한 노란색을 나타내며 주변에 투명한 환을 생성하지 않는 것을 P ediococcus속 Weissella속 후보군으로 분리하면서 Ornithine 생성능 검증을 위해 1% Arginine 첨가된 MRS 배지에 후보 유산균을 배양(30℃ 48h)하고 TLC를 활용하여 유산균의 Ornithine 생성능 여부를 조사하였고 TLC분석에는 silica gel F 254 (Merck Germany) Ornithine(Merck Germany)을 사용하였으며 이동상으로 시행하였다.